NetNado
  Найти на сайте:

Учащимся

Учителям



Клеточные технологии и современная медицина. Н. А. Онищенко



Клеточные технологии и современная медицина.

Н.А. Онищенко.

НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ. г. Москва.

(Директор академик В.И. Шумаков).

XX век можно по праву назвать столетием триумфального развития методов восстановительного лечения необратимо поврежденных органов путем трансплантации донорских органов и клеток.

Признанием огромной значимости для человечества развития трансплантационного направления медицины явилось присуждение в 1990 г. единой Нобелевской премии в области медицины двум выдающимся исследователям-врачам: E.D. Thomas за разработку и внедрение трансплантации клеток костного мозга и G. Murray за разработку и внедрение пересадок почек в клиническую практику.

Благодаря клинической эффективности трансплантационные методы восстановительного лечения получили всеобщее признание, однако, в последние три-четыре десятилетия продолжали изучаться и совершенствоваться преимущественно методы клеточной трансплантации.

Разработке методов клеточной терапии способствовали: повсеместно усиливающийся дефицит донорских органов и высокая себестоимость трансплантации, опасность развития осложнений, сопутствующих большой хирургии, а также чрезвычайно высокий процент инвалидизации и гибели больных от хронических заболеваний жизненно важных органов.

Выяснилось также, что клеточная трансплантация имеет даже ряд преимуществ по сравнению с органными трансплантациями: метод имеет более низкую себестоимость, безопасен, позволяет обеспечить медицинской помощью большее число больных, а также отказаться полностью или использовать слабые иммуносупрессивные препараты.

Стало очевидным, что с помощью метода клеточной трансплантации появляется возможность возмещения отсутствующих клонов специализированных клеток в поврежденных органах, возможность увеличения пула функционирующих клеток, а также активизации в сохранившихся клетках поврежденного органа собственного резерва регенерации и пролиферации.

Первоначально возможности клеточной трансплантации стали изучаться при разработке нетрадиционных методов лечения инсулинзависимого сахарного диабета и ряда дегенеративных заболеваний центральной нервной системы, прежде всего болезни Паркинсона [8,16,17,55].

В дальнейшем клеточные биотехнологии стали использоваться для лечения ишемических и травматических поражений разных органов, для лечения хронических воспалительных и некоторых системных заболеваний, таких как атеросклероз, онкологические заболевания, мышечная дистрофия Дюшенна, болезнь Вильсона и др. Аналитический обзор этих данных содержится в работах ряда отечественных авторов [2,3,10,14,20].

В практике применения клеточных технологий можно четко выделить 2 подхода, которые различаются научно-методологическими принципами, положенными в их основу. Первый подход – более ранний – связан с применением специализированных (дифференцированных) клеток растущих организмов (человека и животных). Второй подход начал развиваться последние 3 -5 лет и связан с разработкой технологий применения недифференцированных (стволовых) клеток человека.

1. Применение специализированных (дифференцированных) клеток из растущих организмов для восстановительного лечения поврежденных органов.


Терапия специализированными донорскими клетками, выделенными из растущих организмов, по сути представляет собой дальнейший этап развития метода тканевой терапии, учитывающий достижения современной клеточной биологии и трансплантационной иммунологии.

Метод провозглашает отказ от медикаментозной коррекции биохимического беспорядка в пораженных клетках и нацелен на возмещение в органах отсутствующих клонов специализированных клеток, а также участие трансплантированных клеток в восстановлении гомеостатических функций сохранившихся клеток пораженного органа.

Технически этот метод клеточной терапии в клинике стали выполнять двумя способами: путем непосредственной трансплантации донорских клеток в строго заданные участки тканей поврежденных органов (например, доставка нейрональных клеток с помощью стереотаксической техники) или доставки клеток в соответствующие органы током крови (например, при интрапортальном введении клеток островковой ткани поджелудочной железы), а также путем дистанционного управления процессами регенерации и пролиферации в поврежденных органах за счет временного размещения донорских клеток в экстракорпоральном контуре перфузионных систем, осуществляющих инкубацию донорских клеток в потоке крови или плазмы больного (например, клеток печени, селезенки) [7,20,35].

Изучение корригирующих возможностей этих двух технически различающихся методов клеточной терапии позволило установить ряд общих закономерностей реализации их воздействия на организм. Было констатировано, что стабильность, выраженность и длительность лечебного эффекта при использовании клеточных технологий находится в прямой зависимости от количества паренхимы, сохранившейся в пораженном органе и способной отвечать на регуляторные сигналы, а также от суммарной массы биологической активности используемого материала. Кроме того, определяющее значение для выраженности и длительности функционирования пересаженных клеток имеет степень биологической (биохимической) адекватности микроокружения, так как именно физиологически активные вещества микроокружения или, как их называют, сигнальные молекулы определяют реализацию генетической программы пересаженных клеток. Наиболее выраженный клинический эффект отмечался при пересадках клеток в органы с аналогичным фенотипом клеток.

Между тем, оказалось, что даже при пересадке дофаминэргических нейронов от поздних эмбрионов (6-9 недель гестации) в ткань мозга, которая, как известно, окружена гемато-энцефалическим барьером, положительная динамика у больных с болезнью Паркинсона обычно нарастала только в течение первых 3-6 месяцев после операции (период развития пересаженных нейронов и установления их связей с мозгом больного) и затем шла на убыль за счет постепенной дегенерации и гибели трансплантированных нейронов.

Было высказано предположение, что гибель трансплантированных нейронов при этом может быть связана с отсутствием в мозге взрослого реципиента микросреды, обеспечивающей их выживание и развитие: отсутствует выработка определенного спектра ростовых нейротрофических факторов эмбрионального или плацентарного происхождения.

Не исключено также, что эмбриональные нейроны, будучи аллотрансплантатами, отторгаются реципиентом, поскольку нервные клетки поздних зародышей человека уже синтезируют антигены гистосовместимости, а стереотаксические манипуляции временно нарушают гематоэнцефалический барьер. В результате трансплантированные клетки становятся доступными не только для антител, но и для активированных лимфоцитов, ответственных за их отторжение и гибель.

Возможно также, что постепенная гибель трансплантированных клеток (даже аутотрансплантированных) и появление активных лимфоцитов могут быть обусловлены отсутствием полной интеграции этих клеток тканями реципиента из-за их предварительной изоляции, которая в последующем ослабляет чувствительность цитоплазматических мембран к сигналам межклеточных взаимодействий.

К тому же, не устраняется первопричина заболевания, и сохраняющиеся патологические воздействия могут способствовать гибели и трансплантированных донорских клеток.

Очевидно, действием всего спектра аналогичных факторов следует объяснять ограниченность сроков клинического эффекта клеточной терапии (не более 6-12 месяцев) и при лечении гипотиреоза, диабета, болезни Вильсона, а также других хронических заболеваний печени и других органов [7,20,21].

В процессе изучения терапевтических возможностей метода клеточной трансплантации стало очевидным, что главным препятствием на пути внедрения клеточных технологий в широкую клиническую практику служат ограничения в получении достаточных количеств биоматериала – специализированных (дифференцированных) клеток с высокой биологической активностью, которой, как известно, обладают клетки из тканей молодых развивающихся организмов.

Для целей терапии использовались клетки из тканей поздних
эмбрионов человека со сроками развития 5-8 недель гестации, когда
заканчивается закладка эмбриональных зачатков тканей и органов; клетки
фетальных тканей человека со сроком развития плода свыше 8-12 недель
гестации, а также клетки из тканей органов новорожденных или
неполовозрелых животных (при необходимости получения больших объемов
клеточной массы). Клеткам из тканей развивающихся организмов отдается особое предпочтение, так как эти специализированные клетки имеют очевидное биологическое преимущество перед специализированными клетками взрослых доноров. Во-первых, большинство фетальных клеток имеют слабо экспресированные комплексы главных антигенов гистосовместимости (МНС-1 и МНС-2). Во-вторых, фетальные органы содержат наряду с уже дифференцированными клетками – бластные и региональные стволовые клетки, наделенные мощным потенциалом пролиферации; в-третьих, фетальные клетки за счет стволовых и бластных популяций, секретируют в организме реципиента уникальный комплекс цитокинов и ростовых тканеспецифических факторов, которые стимулируют регенерацию поврежденных тканей человека.

Чтобы уйти от проблем острого дефицита аллогенного донорского материала и от проблем биоэтики, возникающих при использовании человеческого абортивного материала, в 80-х годах прошлого столетия для клеточной терапии клиницисты стали широко использовать ксеногенный биоматериал.

Так, для лечения инсулинзависимого сахарного диабета была разработана технология получения островковых клеток из поджелудочной железы плодов свиней и коров, а затем из поджелудочной железы новорожденных кроликов.

Для лечения острой и хронической печеночной недостаточности различного генеза в экстракорпоральных контурах систем "Вспомогательной печени" стали использовать гепатоциты свиней препубертатного возраста (до 2 месяцев развития), так как эти клетки обладают не только высоким регенерационным потенциалом, но и способностью к выполнению органоспецифических детоксикационных функций.

Еще в начале 90-х годов прошлого столетия для усиления биорегуляторной активности гепатоцитов их инкубацию в экстракорпоральных контурах перфузионных систем стали проводить совместно с фрагментами селезенки тех же животных [7].

Использование селезенки в комплексном лечении заболеваний печени обосновывалось тем, что будучи важным органом иммуногенеза, селезенка подобно плодным тканям и клеткам костного мозга, даже во взрослом организме, содержит стволовые клетки и сохраняет достаточно высокий уровень обновления своего клеточного состава. Именно поэтому селезенка является мощным источником цитокинов и ростовых факторов – индукторов восстановительных процессов в клетках паренхиматозных органов. Кроме того, было показано, что Т-лимфоциты, которые служат в организме переносчиком регенерационной информации паренхиматозным клеткам нелимфоидных органов, завершают свое превращение в иммунокомпетентную клетку в селезенке, становясь способными к кооперативному взаимодействию с В-лимфоцитами при клеточно-опосредованном гуморальном иммунном ответе. Это обстоятельство и предопределило тот факт, что на протяжении последних 20 лет спленотерапия животными тканями стала интегральной частью комплексного лечения острой и хронической недостаточности функций жизненно важных органов, формирование которых всегда развивалось на фоне выраженного иммунодефицита.

Между тем, сохраняющийся дефицит донорского материала для лечения больных методами клеточных трансплантаций, призыв к ограничению использования ксеногенных источников из-за их более высокой антигенности, опасности заражения прионами и другими инфекциями, а также необходимость стандартизации используемых клеток и приготовления из них клеточных препаратов обусловили в последние 3-5 лет пробуждение необычайного интереса исследователей всего мира к проблеме стволовых клеток и к их так называемому «терапевтическому клонированию».

2. Биологические возможности применения стволовых клеток для восстановительного лечения поврежденных органов.

2.1. Общая характеристика и номенклатура стволовых клеток.


Стволовые клетки (СК) это клоногенные клетки, способные к самообновлению и дифференцировке в другие типы клеток.

СК характеризуются наличием трех главных свойств:

  1. СК ассиметрично делятся, то есть при пролиферации СК вместо образования 2-х одинаковых дочерних клеток одна- дочерняя клетка становится коммитированной (commit – поручать, вверять), способной стать более специализированной, а другая – остается неспециализированной СК;

  2. СК способны к самообновлению, т.е. репопулируют (пролиферируют без дифференцировки) на протяжении неопределенно длительного периода времени или даже в течение всей жизни организма (long-term subset);

  3. СК могут дифференцироваться в специализированные типы клеток (по крайней мере в клетки 2-х различных фенотипов), проходя стадию прогениторных клеток (progenitor - предшественник) из так называемого краткосрочно существующего пула неспециализированных коммитированных СК (short-term subset).

По происхождению различают 2 группы СК – эмбриональные и региональные (взрослые) СК. Потенции генома этих клеток существенно различаются по свойствам и ассортименту воспроизводимых ими специализированных клеток.

Эмбриональные СК (ЭСК) – возникают на ранних стадиях развития зародыша и представляют собой клетки с тотипотентными или плюрипотентными свойствами. Именно эти клетки являются истинно стволовыми клетками в организме. На 2-4 сутки развития зародыша (стадия морулы) формируются тотипотентные СК, которые в условиях in situ способны развиваться до стадии взрослого организма (однояйцевые близнецы).

Оплодотворенную яйцеклетку – зиготу – также относят к тотипотентным СК, поскольку эта клетка воспроизводит все органы эмбриона и необходимые для его развития экстраэмбриональные структуры: хориональную часть плаценты, пуповину и др. Между тем, для биоэтически допустимых экспериментов, а также для получения и сохранения в лабораторных банках тотипотентных ЭСК используют не зиготы, а клетки-дублеры зиготы. Эти клетки получают лабораторным способом в обход процессов полового оплодотворения и беременности путем переноса ядра из какой-либо аллогенной соматической клетки в зрелую донорскую яйцеклетку, из которой предварительно был удален собственный пронуклеус (получение цитогибридов) [33,47].

Обычно же ЭСК выделяют из эмбриобласта на 5-7 сутки развития человеческого зародыша (стадия бластоцисты). Эти клетки плюрипотентны и представляют собой группу зародышевых клеток (около 80-100 клеток), являющихся зачатком всех будущих высокоспециализированных клеток. Клетки эмбриобласта способны дифференцироваться во все типы клеток, производные всех трех эмбриональных зародышевых листков, образовывать любые ткани организма, но не цельный организм, поскольку эти клетки не участвуют в образовании экстраэмбриональных структур (плаценты, пуповины и др.)

ЭСК характеризуются высоким уровнем экспрессии теломеразы [6], а также выработкой специфического транскрипционного фактора Oct-4, который необходим для поддержания фенотипа ЭСК и играет ведущую роль в детерминировании ранних этапов эмбриогенеза и дифференцировки.

Для ЭСК человека характерно также наличие на поверхности мембран ранних эмбриональных антигенов – SSEA-3 и SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, которые позволяют идентифицировать репопуляцонную активность этих клеток.

В более позднюю фазу развития эмбриона (на 5 -12 неделе внутриутробного развития) вплоть до рождения из него выделяют более зрелый тип ЭСК, которые называют СК поздних эмбрионов (5-8 недель гестации) или СК плодов (при сроках более 8 недель гестации).

Поскольку поздние зародышевые (фетальные) СК выделяют на стадии образования зачатков различных органов, то возможности этих клеток к дифференцировке в различные типы специализированных клеток уже ограничены эмбриональным лепестком их происхождения, а также степенью зрелости (дифференцировки). Именно поэтому поздние зародышевые (фетальные) СК относят уже не к плюрипотентным, а мульти- и даже унипотентным клеткам, то есть к клеткам, способным создавать при культивировании лишь ограниченное число клеточных фенотипов.

Мульти- или унипотентность СК поздних эмбрионов (фетальных клеток), присущие им свойства хоминга и клеточного химеризма (см. ниже), а также отсутствие опасности образования из них эмбриотератом при трансплантации во взрослый организм (в отличие от истинных ЭСК, полученных на самых ранних сроках гестации) позволяет рассматривать СК поздних эмбрионов (плодов) как разновидность региональных СК или СК взрослых организмов [6].

Региональные или взрослые СК – являются наиболее зрелым типом СК, которые обнаруживаются в виде редких включений во многих тканях и органах сформировавшегося плода и взрослого организма. Происхождение региональных СК (РСК), а также свойства этих клеток остаются пока недостаточно исследованными и поэтому представления о них не всегда точны и несколько различаются у разных авторов. Морфологически РСК трудно идентифицировать, однако эти клетки экспрессируют некоторые уникальные маркеры, которые позволяют выявлять их в тканях. Так, антиген CD34 представлен на большинстве гемопоэтических СК; Stro-1, CD117, CD133 – на мезенхимальных (стромальных) СК; белок промежуточных филаментов нестин – в цитоплазме нейральных СК и т.д.

Как и ЭСК, РСК относят к числу недифференцированных клеток, которые однако репопулируют циклично в течение длительного периода времени, продолжительность которого определяется сроками сохранности процессов самообновления клеток в органах и тканях.

Принято считать, что при дифференцировке in vivo РСК проявляют лишь унипотентные свойства, за счет которых восполняется пул специализированных клеток и поддерживается стабильность процесса самообновления ткани (физиологическая регенерация). В то же время некоторые авторы [72] полагают, что при повреждении ткани РСК могут приобретать свойства мультипотентных СК и дифференцироваться в другие типы клеток, имеющие общность эмбрионального лепестка происхождения. Между тем, отчетливо мультипотентные свойства РСК в настоящее время показаны лишь при культивировании в условиях in vitro и не для всех типов РСК.

По мере старения организма количество РСК в органах прогрессивно уменьшается. Так, если в зародыше млекопитающих на стадии органогенеза половина всех клеток приходится на провизорные некоммитированные клоны СК, то уже в фетальной печени 1 стволовая гемопоэтическая клетка приходится на 100 000 гематогенных клеток. В кроветворной ткани взрослого человека 1 стволовая клетка приходится на 2-10 млн. коммитированных гемопоэтических клеток (т.е. клеток разной степени дифференцировки) [13].

С возрастом в костном мозге уменьшается не только общее количество гемопоэтических СК, но особенно количество мезенхимальных (стромальных) СК.

Так, если сразу после рождения в костном мозге на 10 000 гемопоэтических СК приходится 1 стромальная СК, то у подростков этих клеток уже в 10 раз меньше; к 50-ти годам на 500 000 кроветворных СК – приходится 1 стромальная СК, а в 70 лет 1 стромальная СК приходится на1 млн. гемопоэтических СК.

Возрастное снижение пула СК в органах может быть обусловлено тем, что более продвинутые в дифференцировке клетки не только конкурируют со стволовыми/прогениторными клетками за лимитирующие факторы питания, но секретируют также в среду факторы, блокирующие мультипотентность генома незрелых клеток [13].

Возрастное снижение пула РСК в органах, их сниженная теломеразная активность, унипотентность и проявление мультипотентных свойств лишь в специально созданных условиях микроокружения, а также трудности выявления четких различий между РСК и клетками-предшественниками, которые, как известно, являются частично дифференцированными клетками, заставляет предполагать, что РСК в органах не являются истинными СК, а являются коммитированными клетками-предшественниками.

2.2. Получение и свойства стволовых клеток


Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК).

ЭСК официально пока не используются в клинической медицине из-за морально-этических и правовых проблем, связанных с прекращением развития человеческих зародышей, а также опасности перерождения отдельных популяций этих клеток в злокачественные тератокарциномные опухоли после трансплантации во взрослый организм (25-30% наблюдений по Odorico et al. [64]). Однако, несмотря на это, в ведущих медицинских центрах мира уже более 5 лет не прекращаются интенсивные научные исследования условий выращивания бессмертных линий ЭСК и их направленной дифференцировки в различные типы соматических клеток, так как технологическая возможность осуществления ген-индуцированной селекции этих клеток делает ЭСК уникальным потенциальным источником сырья для получения промышленных объемов высокоэффективных очищенных стандартизированных клеточных препаратов. Другими словами, ЭСК представляют собой новый мощный биоресурс медицины.

Для получения лабораторных линий дифференцированных соматических клеток обычно используют 3 природных источника ЭСК: бластоцисты человека (4-6 дней гестации), половой зачаток фетусов 4-5- недель развития, а также клетки зародыша на стадии гаструляции (8-12 дней гестации), которые еще поддаются репрограммированию в линии ЭСК.

Однако основным источником сырья для получения клонов ЭСК остаются бластоцисты человека после искусственного оплодотворения яйцеклетки в условиях in vitro. Принято считать, что зародыш на стадии бластоцисты представляет собой "стволовую нишу", в которой четко разделены эмбриобласт и поддерживающие его клетки трофобласта, выполняющие роль своеобразного фидера. Клетки трофобласта вырабатывают кофакторы выживания и защиты, которые необходимы для сохранения и пролиферации плюрипотентных клеток внутреннего зародышевого слоя. Одновременно эти клетки блокируют неконтролируемую пролиферацию эмбриобласта (позже эпибласта) in situ. Только малая доля клеток эмбриобласта на этапе бластоцисты сохраняет тотипотентность, так как только 1-2% клеток удается переводить в бессмертную самопроизводящуюся линию ЭСК [13].

Репрограммирование эмбриобласта в линию ЭСК начинают с механического отделения эмбриобласта от трофобласта. Затем фрагменты эмбриобласта помещают на "фидер" из фетальных фибробластов без факторов, ограничивающих пролиферацию тотипотентных клеток.

Thomson et al. [77] предложили для выращивания ЭСК использовать среду Дульбекко над облученным фидером (ингибирована пролиферация фетальных фибробластов) с одновременным добавлением в среду культивирования 3-х ростовых цитокинов – LIF (leukemia inhibitory factor), IL-6, SCF (stem cell factor). Для более активной пролиферации ЭСК рекомендуется дополнительно использовать FGF-base, EGF, TGF-β.

В последние годы были разработаны методы длительного пассирования ЭСК в течение 1- 2-х и более лет без изменения их гено/фенотипа, причем культуры ЭСК могли пройти за этот срок более 450 циклов самоудвоения без анеуплоидии и малигнизации. Необходимо подчеркнуть, что рост ЭСК в культуре идет клонами с образованием клеточных агрегатов (эмбриоидные тельца).

Образование эмбриоидных телец начинается с агрегации однородных СК, которые пролиферируют и по мере нарастания клеточной массы (клеточности) изменяют состав внутренней локальной микросреды с формированием концентрационных градиентов веществ, которые приводят к изменению экспрессии генов и развитию процессов дифференцировки клеток внутри эмбриоидного тельца. Процесс формирования градиента концентраций веществ протекает динамично по мере нарастания клеток и касается в первую очередь изменений концентраций СО2, NO, O2, глюкозы, а затем состава пептидов и факторов роста. Это в свою очередь меняет характера межклеточных «cell-cell» взаимодействий и ведет к формированию клеток различных по направлению дифференцировки. Когда клеточные агрегаты достигают размеров 50-80 клеток, наступает равновесие между пролиферацией и апоптозом. Спонтанную дифференцировку и гибель клеток обычно предотвращают повторным диспергированием агрегатов.

Дифференцировка ЭСК наступает после смены среды, удаления фидера и LIF, а также добавления сыворотки, что ведет к прикреплению клеток к подложке, образованию монослоя и формированию их цитоскелета.

Для прикрепления клеток к подложке добавляют не только сыворотку, но и индукторы цитодифференцировки в строго определенных концентрациях, преимущественно белки, которые участвуют в ранних стадиях формирования различных клеточных типов. Для этих целей используют активин А, который индуцирует преимущественно мезодермальную дифференцировку и главным образом образование мышечных клеток (скелетных, кардиомиоцитов); эпидермальный фактор роста, который индуцирует образование мезодермальных и эктодермальных клонов (специфичен для образования клеток кожи); нейрогенный фактор роста, который способствует образованию клонов клеток мезодермы, эктодермы и эндодермы (специфичен для образования клеток печени и эндокринной части поджелудочной железы). При обработке ЭСК нейрогенным фактором роста и ретиноевой кислотой формируется клеточная популяция, содержащая около 50% клеток, несущих маркеры нервных клеток (окраска антителами к нестину, виментину, polysyalated – NCAM, MAP-2, NeuN, betaIII-tubulin) [13].

Предполагают, что ретиноевая кислота может также выступать в роли индуктора образования мультипотентных мезенхимальных клонов в культуре, которые далее в зависимости от используемых доз и дополнительного набора сигнальных молекул и генов "второго эшелона", определяющих направление цитодифференцировки, воспроизводят адипогенез, миогенез, кардиогенез и т.д.

Экспрессии генов созревания кардиомиоцитов способствует также добавление в среду культивирования ДМСО, который выполняет роль вектора для доставки гидрофобных сигналов (ретиноевая кислота, цитокины с гидрофобными доменами) в ядро ЭСК. Накопление кислородных радикалов и электрическая стимуляция ЭСК в культуре также ускоряют образование зрелых спонтанно сокращающихся кардиомиоцитов [48]. Показано [51], что в эмбриональных агрегатах ЭСК можно добиться также дифференцировки клеток в хондроциты, причем в роли главных сигналов хондрогенеза выступают подобранные концентрации белков BMP-2, BMP-4 и TGF-β, вырабатываемых, как известно, клетками мезенхимы. Фидер OP9 из стромальных клеток, а также VEGF, FGF-β и HGF поддерживают рост эндотелиальных клонов мезодермы.

Показано, что дифференцировка ЭСК в нейроны, кардиомиоциты и клетки других фенотипов (хондроцитов) идет in vitro в среднем 10-15 дней, тогда как аналогичный процесс в зародыше занимает 5-7 дней. Очевидно, это связано с тем, что наработка соматических клеток из ЭСК идет в обход эмбриогенеза, когда отсутствуют условия для организованного взаимодействия мезенхимы и провизорных клонов клеток всех трех зародышевых листков. В результате только часть событий клеточного и органного морфогенеза хаотически воспроизводится в культуре эмбриоидных агрегатов.

Важно отметить также, что при создании условий дифференцировки клеток в определенном направлении только незначительная часть клеток начинает проявлять свойства заданного фенотипа (не более 1/3). Именно поэтому получение клеток определенного фенотипа пока представляет собой непростую задачу, решение которой осуществляется путем этапных воздействий определенными химическими сигналами на спонтанно формирующиеся эмбриоидные агрегаты ЭСК (обычно мыши и/или человека) с расшифровкой экспрессирующихся при этом генов, а также путем ген-индуцированной стимуляции дифференцировки в предварительно трансфецированных ЭСК [13]. Так, стимуляции кардиогенеза в ЭСК достигают избыточной дозой введенного в клетки гена Nкх-5-2, эритропоэза – избыточной дозой Hох-B4, нейрогенеза - избыточной дозой Neuro-D, миогенеза – MyoD гена. Дифференцировка эмбриоидных агрегатов ЭСК в гепатоциты достигалась введением в клетки гена резистентности к бластоцидину S (антибиотик) под промотор маркерного гена Oct4, а также использованием селективного красителя индоцианина зеленого для отбора колоний появляющихся гепатобластов, которые далее в культуре дифференцируются до кластеров распластанных гепатоцитов. Получениию инсулин- и глюкагон-секретирующих клеток сопутствует осуществление направленной дифференцировки эмбриоидных агрегатов ЭСК в клоны нейральных стволовых клеток, обогащенных нестин+.-клетками, т.к. образование гормон-продуцирующих клеток всегда происходило среди колоний нейросфер и параллельно дифференцировке нейральных стволовых клеток. В результате культивирования в таких условиях 18% нейросфер дифференцировались в инсулин- и глюкагон-секретирующие клетки, а 20% нейросфер – дифференцировалось в клетки с нейрональными и гормон-продуцирующими свойствами одновременно [13].

Так как клетки, образующиеся в процессе дифференцировки ЭСК, приобретают способность стабильно и длительно сохранять свой фенотип в лабораторных условиях (в отличие от РСК), то это свойство искусственно полученных соматических клеток открывает перспективу наработки и хранения терапевтически эффективных доз дифференцированных клеток, а также применения их с лечебными целями.

Например, в опытах на животных уже показано [36,48], что кардиомиоциты, выращенные in vitro из плюрипотентной зародышевой ткани, активно встраиваются в миокард развивающихся зародышей (тканевой химеризм), а также в ишемически поврежденную ткань. Предшественники олигодендроцитов, лабораторно полученные из ЭСК, при трансплантации стимулируют ремиелинизацию в поврежденном мозге животных [31,58].

Лабораторно полученные бета-клетки снимают гипергликемию у животных с экспериментальным диабетом [73].

Ярко выраженные потенции ЭСК к репопулированию и дифференцировке в различные типы соматических клеток in vitro и отчетливо выявившаяся возможность осуществления ген-индуцированной селекции ЭСК являются важнейшими предпосылками для реализации промышленного получения высококачественных стандартизированных клеточных линий клеток заданного направления дифференцировки (получение клеточных препаратов); возможность проведения ген-индуцированной селекции позволяет также устранить условия для появления в культуре недифференцирующихся (онкогенных) клонов клеток, создающих опасность перерождения их в тератокарциномные опухоли при трансплантации.

Технологические достижения последних лет обусловили тот факт, что ЭСК стали наиболее привлекательным и многообещающим объектом исследований в современной клеточной биологии и медицине [13,29,41].

Между тем, отсутствие удовлетворительного законодательного решения проблем терапевтического клонирования ЭСК человека как в России, так и других странах мира тормозит изучение клинической эффективности применения предифференцированных ЭСК, а также препятствует оценке предложенных способов защиты реципиентов от переноса им при трансплантации онкогенных клонов клеток. В результате ЭСК пока по прежнему остаются только уникальным объектом лабораторных и экспериментальных исследований.

Региональные (взрослые) СК.


Региональные СК (РСК), в частности аутологичные СК костного мозга, в отличие от ЭСК, уже используются в клинике для восстановительного лечения нарушенных функций сердца, печени, а также для устранения дефектов костей [18,25,66,67,74,83] и заживления ожоговых ран [11]. Активное использование РСК для целей регенерационной медицины оказалось возможным благодаря отсутствию правовых ограничений на их применение, доступности получения, онкологической безопасности и иммунологической совместимости этих клеток, т.к. донорами РСК обычно являются сами реципиенты (больные).

В отличие от плюрипотентных ЭСК – РСК уни-, ди- и мультипотентны. Они имеют сниженную популяционную активность (низкая активность теломеразы) и ограниченный потенциал дифференцировки.

Именно поэтому для РСК в условиях in vitro и in vivo особенно важны сигналы культурального и тканевого микроокружения, под влиянием которых РСК дифференцируются в соответствующие зрелые специализированные клетки, поддерживая стабильность процессов самообновления органов и тканей (физиологическая регенерация). Для некоторых типов РСК (СК костного мозга) доказана их способность к миграции в зону поражения.

Проблемы, возникающие при использовании РСК для клеточной терапии, связаны с тем, что еще недостаточно изучены факторы их дифференцировки in vivo и in vitro: отсутствуют окончательные ответы на вопросы: можно ли повысить пролиферативную активность РСК in vitro для получения достаточных количеств донорского материала и какие сигналы in vivo регулируют процессы пролиферации и дифференцировки этих клеток; кроме того, отсутствуют стандартизированные и не слишком дорогостоящие технологии получения очищенных РСК и не изучены возможности устранения возрастного снижения количеств РСК в органах и их терапевтической эффективности.

Остаются не изученными механизмы реализации терапевтических эффектов РСК в организме, связь биологической активности собственных РСК, с тяжестью состояния больного, возможность восстановления нарушенных функций необратимо поврежденного органа с помощью тех аутологичных РСК, которые длительное время находились в организме в условиях ингибирующего воздействия на них факторов развивающегося иммунодефицита и т.д.

Основным источником получения РСК для клеточной терапии служат собственные ткани взрослого человека. Перечень тканей, содержащих СК, постоянно расширяется, и в настоящее время включает: костный мозг, периферическую и пуповинную кровь [15,82], головной мозг (зубчатое ядро гиппокампа, обонятельная луковица и субэпиндимальная зона латеральных желудочков) и спинной мозг [75,39], дентальную пульпу, кровеносные сосуды [49,69], скелетные мышцы (сателлитные клетки) [53], эпителий кожи [72] и пищеварительного тракта [70,72], роговицу, ретину, печень [22,76] и поджелудочную железу [43,85].

Практически наиболее удобными источниками получения РСК из органов взрослого человека являются: костный мозг, периферическая и пуповинная кровь [15,32,79], а также биопсийный материал (глубокие слои носоглоточного эпителия, имеющие нейрональное происхождение, клетки печени, эпителий кишечника и др.).

Поскольку свойства СК поздних эмбрионов и плодов близки к свойствам РСК взрослых организмов (они отличаются более высокой популяционной активностью), то абортный материал также может служить источником получения РСК, начиная с 5-8-12 недели гестации.

Перед трансплантацией РСК культивируют – освобождают от тканевого балласта и создают условия для клонирования и дифференцировки, так как известно, что выход СК в дифференцировку и направление дифференцировки регулируются сигналами микроокружения и их специфичностью [6].

При культивировании РСК, как и при культивировании ЭСК, выявляется общая закономерность выживания клеток в культуре. Она состоит в том, что при создании условий направленной дифференцировки клеток только часть клеток обнаруживает свойства дифференцировки в заданном направлении (это подтверждается особенностями морфологической структуры, гистохимическим или иммуно-гистохимическим выявлением маркерных белков ). Остальные клетки (до 2/3 клеточной популяции), образуя структуры кластеров с дифференцированными клетками, относятся к клеткам иного направления развития. Эти клетки имеют общность эмбрионального происхождения с дифференцированными клетками и очевидно, в культуре выполняют функции фидерного слоя. Так, нейроциты в культуре окружены клетками глии, также имеющими эктодермальное происхождение [9,12], миоцито- и кардиомиоцитоподобные клетки окружены фибробластами – клетками мезодермального происхождения [19].

Невозможность выклонировать чистую культуру дифференцированных клеток подтверждает, по нашему мнению, участие РСК в формировании структурной целостности ткани и в создании ее апуд-системы, обеспечивающей адекватное функционирование в ней специализированных клеток.

Неудивительно поэтому, что и в условиях in vitro или при повреждении тканей РСК проявляют свои уни-, ди- или мультипотентные свойства, дифференцируясь в клетки тех тканей, из которых они происходят.

Так, из фракции гемопоэтических СК костного мозга могут быть получены клетки крови и иммунной системы; из фракции стромальных СК костного мозга – другие клетки мезенхимального происхождения: остеобласты, хондроциты, фибробласты, тендоциты, миоциты, кардиомиоциты, адипоциты и др. [46,57,68]; из нейрональных СК могут быть получены различные нейроны (холинэргические, пептидэргические, дофаминэргические, GabA-эргические и др.), а также глиальные клетки (астроциты, олигодендроциты, шванновские – миелинпродуцирующие клетки, клетки микроглии) и клетки наружного (кожного) эпителия [61,80]; из СК печени (овальные клетки) могут быть получены гепатоциты и эпителий желчных протоков [42,56,78]; из СК кишечного эпителия – α, β, и γ клетки поджелудочной железы, а также эпителий кишечника [28]; из прогениторных эпителиальных клеток поджелудочной железы – гепатоциты [34], и т.д.

В последние годы РСК стали объектом особенно пристальных исследований. Стали появляться работы, указывающие на способность РСК дифференцироваться in vivo не только в клетки того органа или той системы организма, к которой они принадлежат, но и в клетки других органов и тканей, происходящих даже из другого зародышевого листка. Это свойство РСК, названное пластичностью [30,52] или трансдифференцировкой [24,54], возбудило надежды на возможность регенерации практически любого поврежденного органа и явилось причиной, теперь уже правда стихающего, бума вокруг уникальности терапевтических свойств этих клеток (источники получения "запчастей" организма). Так, в ряде работ утверждалось, что СК нервной ткани могут превратиться в миоциты и гемопоэтические клетки [40,80], СК печеночной ткани в миоциты [59]; появились утверждения, что гемопоэтические СК костного мозга также могут трансдифференцироваться в скелетные мышцы [38,44], гепатоциты [54], эпителиальные клетки [52], нейроглию [37], нейроны [30,60], эндотелиальные клетки и кардиомиоциты [45,66] после трансплантации их в соответствующие поврежденные ткани организма. Для доказательства трансдифференцировки гемопоэтических СК использовали клетки костного мозга, которые предварительно маркировали GFP (зеленый флуоресцирующий протеин). После пересадки таких клеток, например, в поврежденный миокард часть кардиомиоцитов становилась меченной этим красителем, и это дало авторам основание утверждать, что произошло превращение клеток костного мозга в клетки сердечной мышцы [66].

Аналогичные сведения приводят Jackson с соавторами (45), которые, вводя облученным грызунам в зону инфаркта фракцию стромальных клеток костного мозга, обнаруживали затем в этих клетках кардиоспецифический белок – тропонин.

Во все увеличивающемся числе работ признается, что при повреждении миокарда, печени, мозга и других органов костный мозг служит поставщиком клеток-предшественников для этих органов, поскольку клетки регенерирующих органов после трансплантации костного мозга приобретают черты донорского фенотипа. Однако остается неясным: какие клетки костного мозга поступают в поврежденные органы и каким путем они участвуют в процессах регенерации – путем трансдифференцировки или путем клеточного слияния (fusion), то есть химеризации (гибридизации) клеток?

В подавляющем большинстве работ последних 2-х лет с помощью молекулярно-генетического метода – RT PCR, позволяющего по специфичности ДНК выявлять индивидуальные (клеточноспецифические) поверхностные маркерные белки, метода FACS (fluorescence-activated cells sorter), цитогенетического метода FISH (fluorescence in situ hybridisation), исключительно точного при наличии различий между кариотипом донора и реципиента, было установлено, что гемопоэтические СК костного мозга участвуют в процессах регенерации не за счет их трансдифференцировки, а преимущественно путем их слияния (химеризации) с клетками поврежденного органа [23,62,63,81].

Следует заметить, что слияние клеток является, по-видимому, одним из распространенных механизмов клеточного выживания в организме. Склонность к слиянию имеют моноциты, макрофаги (образование гигантских клеток с несколькими ядрами вокруг инородного тела, слияние В-лимфоцитов с дендритными клетками), а также эритроциты. Возникновение "гибридных эритроцитов", имеющих антигенные маркеры и донора и реципиента, рассматривается даже как непременный атрибут HLA-идентичных трансплантаций костного мозга [4]. Гибридные многоядерные клетки (со свойствами и донора, и реципиента) после трансплантации костного мозга обнаруживают также в гепатоцитах регенерирующей печени, в клетках миокарда, в эпителии почки, органах желудочно-кишечного тракта и в эпителии тимуса, что может приводить к толерантности по отношению к донорским клеткам [22,23,27,50,65,71].

Известно, что для реализации процесса гибридизации соматических клеток необходимо: слияние мембран контактирующих клеток, для чего они должны быть обратимо повреждены, а также наличие у контактирующих клеток высокого пролиферативного потенциала. В результате в момент деления таких клеток, когда их ядерные оболочки исчезают, создаются реальные условия для слияния хромосом и образования гибридной клетки [1]. Неудивительно поэтому, что большинство авторов подчеркивает необходимость для гибридизации высокого пролиферативного уровня контактирующих клеток. Именно такие условия возникают при терапии СК костного мозга, которые сами обладают высокой популяционной активностью и которые при введении в ткань пораженного органа вступают в контакт с его регенерирующими клетками.

Особого внимания заслуживает еще одно обстоятельство. Показано, что усиленный синтез ДНК клетками регенерирующих органов сопровождается явлением реутилизации ДНК их клеток другого гистотипа, в частности, из введенных лимфоидных клеток.

Из этих наблюдений можно заключить, что костный мозг, будучи лимфоидным органом, становится донором клеток-предшественников мононуклеарного ряда, ядерный материал которых может принять участие в процессах слияния (химеризации) клеток. Работы последних лет не исключают возможность существования таких механизмов [23,84], так как было показано, что при введении свежевыделенных клеток костного мозга они сливались с соматическими клетками печени, головного мозга и сердца без признаков их трансдифференцировки, но при этом в значительной части трансплантированных клеток (выявлялись по GFP) экспрессировались клетки с антигенами CD45+ (лейкоциты) и в меньшей степени с антигенами CD3+ (Т-лимфоциты); остальные клетки идентифицировались как фибробласты. В работе Balsam et al. [26] было также подтверждено, что фракция долгоживущих гемопоэтических СК (c-kitenz, Lin-c-kit+ и c-kit+Thy1.1lo Lin-Sca-1+), введенная в ишемизированный миокард мышей и выявляемая по GFP, не экспрессирует кардиоспецифические белки, а также маркеры гладко-мышечных или эндотелиальных клеток (α-актинин, коннексин, гладко-мышечный актин). В то же время, эти клетки дифференцируются исключительно в традиционные гемопоэтические клетки, генерируя образование миелоидных (CD45, Gr-1), реже В-лимфоидных (В220) и еще реже Т-лимфоидных (CD3) типов клеток, одно из назначений которых, как известно, участвовать в иммунной регуляции местных восстановительных процессов.

Если все-таки признать существование механизма трансдифференцировки РСК (и, прежде всего, гемопоэтических СК костного мозга) в клетки иного гистотипа, то возникает ряд вопросов, которые требуют специальных ответов.

Один из них состоит в том, почему СК, например, нервной ткани, печени, гемопоэтической ткани, "охотно" превращаются в клетки другой ткани и весьма пассивно участвуют в регенерации собственной ткани. Второй вопрос касается способности СК вызывать процесс дедифференцировки и сделать его полным перед трансдифференцировкой. Между тем, с помощью современных методов исследований не удается подтвердить существование механизмов дедифференцировки в клетках регенерирующих органов. Был подтвержден лишь возврат при этом к более ранним стадиям зрелости клеток, без утраты ими своего исходного гистотипа, причем глубина этого процесса при регенерации разных тканей была неодинаковой [5].

Из клетокже костного мозга только лимфоциты способны превращаться в менее зрелые формы – лимфобласты и приобретать утраченную способность к делению. Гемопоэтическая СК по своим морфологическим признакам имеет сходство с малым лимфоцитом и поэтому возможность превращения ее в клетки других тканей требует строгих доказательств, получение которых по-видимому следует ожидать в опытах с культурами клеток.

Имея некоторый опыт работы со СК костного мозга, в том числе с клетками гемопоэтического ряда [18,19] мы подтверждаем их чрезвычайно активную роль в ускорении восстановительных процессов в поврежденных органах и тканях. Мы однако полагаем, что эту важную роль СК костного мозга реализуют не за счет заместительных, а за счет своих индуктивных и информационных свойств, высокий уровень которых поддерживается в этих клетках уровнем их популяционной (генной) активности и адекватным микроокружением. Использование СК от пожилых доноров и трансплантация их в зоны с глубоким нарушением трофики (развитие фиброза) должно «очевидно» вести к ослаблению их регуляторной роли.

3. Перспективы развития клеточных технологий


Можно утверждать, что современная медицина уже приступила к использованию клеточных технологий для лечения различных заболеваний которые по сути представляют собой аномальное поведение отдельных клеточных популяций в организме и которые могут быть скорректированы клеточными факторами молодых здоровых клеток.

Главным препятствием на пути внедрения этих технологий в широкую клиническую практику служат 2 обстоятельства: сохраняющихся дефицит ауто- и аллогенного донорского материала с выраженной популяционной активностью (мог бы в значительной мере быть нивелирован использованием ЭСК и РСК), и отсутствие пока убедительных доказательств получения выраженных и пролонгированных клинических эффектов, у больных с хроническими системными и аутоиммунными заболеваниями, нуждающихся в таких результатах.

Для решения проблемы нехватки клеточного биоматериала особые надежды возлагаются на расширенное использование ЭСК после того как в отдельных странах и в мировом сообществе в целом будут отработаны и согласованы различные этико-правовые аспекты терапевтического клонирования этих клеток, а также будут утверждены консенсусные документы.

Технологическая возможность осуществления длительного (многолетнего) пассирования ЭСК без анеуплоидии и малигнизации, возможность осуществления ген-индуцированной дифференцировки и безопасной селекции этих клеток превратят ЭСК в уникальный и неисчерпаемый источник сырья для получения промышленных объемов стандартизированных клеточных препаратов.

Переход к использованию предифференцированных клеток из ЭСК по сути позволит полностью решить проблему нехватки высокоэффективных клеточных препаратов в медицине.

Однако, даже при решении этических, правовых и технологических проблем останется необходимость построения рациональной системы применения СК у больных при разных патологических состояниях, с определением показаний и противопоказаний к их применению. Ясно, что такая система должна учитывать новейшую информацию о биологии СК и должна основываться на четких представлениях о механизмах регуляции и дизрегуляции восстановительных процессов в поврежденных органах больного организма.

Эта система должна строиться с учетом понимания причин угнетения активности собственных РСК и торможения механизмов их естественной дислокации (в частности, СК костного мозга) в кровоток и очаги повреждения, а также с учетом понимания механизмов цито- и гистогенеза в поврежденных тканях на уровне межклеточных взаимодействий: донорских СК со здоровыми и поврежденными клетками реципиента. Такие исследования необходимо развивать, особенно интенсивно на этапе доклинического изучения возможностей клеточной терапии предифференцированными РСК и ЭСК.

.

Список литературы к статье Н.А.Онищенко

«Клеточные технологии и современная медицина»


  1. Бабаева А.Г., Курило Л.Ф., Зотиков Е.А., и др. БЭБиМ. 2003. №1. с 86-89.

  2. Берсенев А.В. Крашенинников М.Е. Онищенко Н.А. Вестник трансплантологии и иск. органов. 2001. №2, С 46-53.

  3. Викторов И.В. Сухих Г.Т. Вестник РАМН. 2002. №4 с.24-30.

  4. Зотиков Е.А. Клиническая Лабораторная Диагностика. 2000. №3 с.46-47.

  5. Зотиков Е.А., Бабаева А.Г., Порешина Л.П. 2003., Москва. Изд. Хризостом 110 с.

  6. Малайцев В.В. Богданова И.М. Сухих Г.Т. Архив патологии. 2002. №4 с.7-11.

  7. Онищенко Н.А., Базиева Ф.Х., Иванова-Смоленская И.А., и др. Вестник трансплантологии и иск. Органов. 1999. №1, 54-59.

  8. Отеллин В.А. Вопросы нейрохирургии. 1999, №4 с.32-37.

  9. Полтавцева Р.А., Ржанинова Р.А., Ревищин А.В., и др. БЭБиМ. 2001. том 132, №9.с 290-293.

  10. Потапов И.В. Крашенинников М.Е. Онищенко Н.А. Вестник трансплантологии и иск. Органов. 2001. №2. с 54-62.

  11. Расулов М.Ф. Тихоокеанский мед.журнал. 2004, №1 (15), с 7-9.

  12. Ревищин А.В., Полтавцева Р.А., Марей М.В., и др. БЭБиМ.. 2001. Том 132, №9, с 285-289.

  13. Репин В.С., Ржанинова А.А., Шеменков Д.А. «Эмбриональные стволовые клетки: Фундаментальная биология и медицина». 2002, изд. РеМеТекс, Москва, 220 с.

  14. Репин В.С. Сухих Г.Т. «Медицинская клеточная биология.» изд. БЭБиМ. 1998. 200с.

  15. Румянцев А.Г., Масчан А.А., «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей.» Изд. Медицинское информ. Агентство, Москва, 2003, 910 с.

  16. Угрюмов М.В. Наука Долголетия 2001 №1 с.9-17.

  17. Шумаков В.И. Блюмкин В.Н. Скалецкий Н.Н. «Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы.» М. Канон. 1995. 382 с.

  18. Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Онищенко Н.А и др. Российский кардиологический журнал 2003, №5, с 42-50.

  19. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., и др. Вестник трансплантации и иск. органов 2002, 4, 3-6.

  20. Шумаков В.И., Писаревский А.А., Онищенко Н.А., и др. в кн. «Очерки по физиологическим проблемам трансплантологии и применения иск. органов». 1998, изд. Репроникс, Тула, с 338-367.

  21. Шумаков В.И., Скалецкий Н.Н. в кн. «Очерки по физиологическим проблемам трансплантологии и применения иск. органов». 1998, изд Репроникс, Тула, с 93-118.

  22. Alison, M R., Sarraf C. J.Hepatol. 1998. 29, 678-683.

  23. Alvarez-Dolado M., Pardal R., Garcia-Verdugo J., et al. Nature 2003, 425, 968-972.

  24. Anderson D.F., Gage F.H. and Weissman I.J. Nat. Med. 2001. 7, 393-395.

  25. Assmus B., Schachinger V., Teupe C., et al. Circulation 2002, 206, 3009-3017.

  26. Balsam J., Wagers A., Christensen J. et al. Nature 2004, 428, 668-673.

  27. Blau H.M., Brazelton T.R., Weimann J.M. Cell. 2001, 105, 829-841

  28. Bonner-Weir S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000, 97, 7999-8004.

  29. Boyle R.J., Savulecku J. BMI., 2001, 323, 1240-1243.

  30. Brazelton T.R., Rossi F.M., Keshet G.I. and Blau H.M. Science. 2000. 290. 1775-1779.

  31. Brustle O., Jones K., Lereash R. Et al.Science, 1999, 285, 754-756.

  32. Cairo M.S., Wagner J.E. Blood 1997, 90: 4665-4678.

  33. Cibelli J., Stice S.I., Robl J.M. et al. Nature Biotechnol. 1998, 16, 642-646.

  34. Dabeva M,. Hwang S.G. Rao G. Vasa et al. Proc. Natl. Acad Sci USA 1997, 94, 7356- 7361.

  35. Demetriou A.A., Rozga J, Podesta L. et al. Scand J. Gastroenterol. 1995, 30, suppl. 208., 111-117.

  36. Doevendans P.A., Kubalak S.W., An R.H. et al. J.Moll. Cell.Cardiol., 2000, 32, 839-851.

  37. Eglitis M.A., Mezey E. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1997, 94, 8: 4080-4085.

  38. Ferrari G., Cusella-de Angels G., Coletta M., and Mavilio F. Science, 1998. 279, 1528-1530.

  39. Gage F. Science, 2000, 287, 1433-1438.

  40. Galli R, Borello U, Gritti A et al. Nat.Neurosci, 2000, 3, 10: 986-991.

  41. Geiger H., Sick S., Bonifers C. et al. Cell, 1998, 93, 1055-1065.

  42. Germain J., Noce M., Gourdeau H., and Marcean N. Cancer Res., 1988. 48, 368-378.

  43. Gmyr V., Kerr-Conte J., Belaich S. et al. Diabetes 2000, 49, 1671- 1680.

  44. Gussoni E., Soneoka Y., Strickland C., et al. Nature, 1999, 401, 390-394.

  45. Jackson K., Majka S, Wang H., et al. J.Clin. Jnvest, 2001, 107, 1395-1402.

  46. Jaiswal R.K., Jaiswal N, Bruder S.P. et al. J. Biol.Chem. 2000, 275, 13, p 9645-9652.

  47. Kato V., Tani T., Sotomaru V. et al. Science, 1999, 288, 2095-2098.

  48. Kehat I., Kenyadin Karsenti D., Snirm et al. J. Clin. Invest., 2001, 108, 407-414.

  49. Keller G. “The hemangioblast.” Cold Spring Harbon, New York: Cold Spring Harbon Laboratory Press, 2001, p 329-348.

  50. Korbling M, Katz R.L., Khanna A., et al.N.Engl.J.Med. 2002, 346, 10: 738-746.

  51. Kramer J., Hegert C., Guan K. et al Mech. Dev., 2000, 92, 193-205.

  52. Krause D.S., Theise N.D., Collector M.J. Henegariu O., Hwang S., Gardner R., Neutzel S., and Shrkis S.J., Cell. 2001. 105, 369-377.

  53. Kuznetsov S.A., Mankani M.N., Gronthos S. et al.J.Cell Biology 2001, v 153, 5, p 1133-1140.

  54. Lagasse E., Connors H., Al Ghalimg M. et al. Nat. Med. 2000. 6. 1229-1234.

  55. Lafferty K.J. Diabetes Nutr. Metab. 1989, 2, p 323-332.

  56. Lazaro C.A., Rhim J.A., YamadaY. And Fausto N. (1998). Cancer Res. 58, 5514-5522.

  57. Liechty K.W., Mac-Kenzie T. C., Shaaban A. еt al. Nature medicine 2000, 6, 11, p 1282-1286.

  58. Liu S., Qu V., Stewart T. J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 2000, 97, 6126-6131.

  59. Malouf N.N., Coleman W.B., Grisham W., et al. Am.J.Pathol. 2001, 158: 1929-1935.

  60. Mezey E., Chandross K.J., Hazta G., et al. Science, 2000. 290, 1779-1782.

  61. Morrison S.J., White P.M., Zockc.,and Anderson D.J., Cell, 1999. 96, 737-749.

  62. Murry CH., Soonpaa M., Reinecke H.,et al. Nature. 2004. 428, 664-668.

  63. Nygren J., Jovinge S., Breitbach M., et al. Nature Medicine 2004, 105, 494-501.

  64. Odorico Y. S., Kanfman D. S., Thomson Y. A. Stem Cells. 2001, 19, 193-204.

  65. Okamoto R., Yajima T., Yamazaki M., et al. Nat. Med. 2002, 8, 1011-1017.

  66. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., et al. Nature. 2001. 410, 701-705.

  67. Perin E.C., GengY.-J., Willerson J.T. Circulation 2003, 107, 935-938.

  68. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. Science, 1999, 284, p 143-146.

  69. Poole T.Y., Finkelstein EB., and Cox CM. Dev.Dyn. 2001. 220, 1-17.

  70. Potten C. Phil.Trans. R.Soc. Lond. B. 1998. 353, 821-830.

  71. Poulsom R., Forbes S.J., Hodivala-Dilke K., et al. Pathology 2001, 195: 229-235.

  72. Slack J.M. Science 2000, 287, 1431-1433.

  73. Soria B., Roche E., Bema G. et al. Diabetes, 2000, 49, 157-162.

  74. Stauer BE., Kornowski R. Ciculation 2003, 107, 929-934.

  75. Temple S., and Alvares-Buylla A. Curr. Opin. Neurobio Pathol. 1999. 9, 135-141.

  76. Theise N.d., Saxena R., Portmann B. et al. Hepatology, 1999, 30, 1425-1433.

  77. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S. S. et al. Science, 1998, 282, 1145-1147.

  78. Thorgeirsson S.S. Am. J. Pathol. 1993. 142, 1331-1333.

  79. To L.B., Haylock D.H., Simmons P.J., Juttner C.A. Blood, 1997, 89, 2233-2258.

  80. Vescovi AJ., Gritti A., Galli R., and Parati EA J. Neurotrauma. 1999. 16, 689-693.

  81. Wang X.,Willenbring H., Akkari Y et al. Nature 2003, 422, 897-901.

  82. Weissman J.F. Cell. 2000. 100, 157-168.

  83. Yau TM., Tomita SH., Weisel RD., et al. Ann. Thorac. Surg. 2003 75, 169, 177.

  84. Ziegelhoeffer T., Fernandez B., Kostin S. et al. Bone. Circul. Res. 2004, 94, 230-238.

  85. Zulewski H., Abraham E.Y., Gerlach M.J., et al. Diabetes., 2001. 50, 521-533.



страница 1


скачать
Другие похожие работы: