Полимерные гидрогели для иммобилизации лекарственных веществ, обладающие эффектом памяти

ПОЛИМЕРНЫЕ ГИДРОГЕЛИ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИЕ ЭФФЕКТОМ ПАМЯТИ

В. Н. Павлюченко, С. С. Иванчев, О. Н. Примаченко, С. Я. Хайкин , В. Ф. Даниличев, В. С. Прошина, В. А. Трунов, В. Т. Лебедев, Ю. В. Кульвелис
Методом матричного синтеза при использовании в качестве матрицы лекарственного вещества – цефазолина синтезированы гидрогели на основе сшитых сополимеров 2-гидроксиэтилметакрилата и функциональных мономеров (акриловая кислота или диметиламиноэтилметакрилат), обладающие эффектом памяти. Показано, что полученные гидрогели имеют повышенную сорбционную активность по отношению к целевому лекарственному веществу и при определенных условиях замедленную скорость высвобождения лекарства из гидрогеля (эффект памяти). Синтезированные гидрогели в сочетании с цефазолином можно рассматривать как новую лекарственную форму пролонгированного действия для лечения инфекционных заболеваний.

ВВЕДЕНИЕ

Полимерные гидрогели уже давно успешно используются в качестве носителей лекарственных веществ. Преимущества таких систем связаны с возможностью реализации контролируемого поступления лекарства в соответствующие зоны живого организма и со снижением токсического действия препарата благодаря его постепенному высвобождению из гидрогеля, что исключает возникновение мгновенных высоких локальных концентраций лекарства. При лечении и профилактике офтальмологических заболеваний в качестве полимерного носителя используют гидроге-левые мягкие контактные линзы, насыщенные лекарственными веществами. В дополнение к указанным преимуществам гидрогелей мягкие контактные линзы локализуют зону поступления лекарства в области роговицы, через которую вещество большей частью поступает во внутренние структуры глаза.

Одна из проблем, возникающих при применении мягких контактных линз, заключается в их малой массе (обычно менее 20 мг) и, следовательно, недостаточной сорбционной емкости по отношению к сорбируемым лекарствам. Указанные обстоятельства не всегда позволяют создавать в

тканях глаза терапевтически эффективные концентрации лекарственного вещества. Другая проблема обусловлена небольшой толщиной мягких контактных линз (менее 100 мкм), что приводит к быстрому высвобождению лекарства. Эти проблемы решают путем введения в состав полимера различных функциональных групп. Обычно функциональные группы являются ионогенны-ми, что в совокупности с ионным характером лекарственного вещества обеспечивает высвобождение лекарства из гидрогеля по механизму ионного обмена. Принципиально новым подходом, активно развиваемым в последнее время, является создание полимерных гидрогелей, обладающих памятью по отношению к целевому веществу [1–5]. Эффект памяти реализуется путем матричного синтеза полимера в присутствии лекарственного вещества, используемого в качестве матрицы, и экстрагируемого после завершения синтеза. Формируемая нанопористая структура гидрогеля, при правильно выбранных условиях синтеза, приводит к увеличению его сорбцион-ной емкости и снижению скорости высвобождения лекарства. В англоязычной научной литературе полученные таким образом гидрогели называют “imprinted” (впечатанные гидрогели). В дальнейшем мы также будем пользоваться термином “imprinted”, особенно в тех случаях, когда эффект памяти гидрогеля по отношению к лекарственному веществу еще не выявлен (на стадиях исследования процессов синтеза и определения параметров набухания гидрогелей в водной среде).

В данной статье описаны синтез и физико-химические свойства новых полимерных гидрогелей, обладающих эффектом памяти. В качестве модельного лекарственного вещества применяли цефазолин (антибиотик из группы цефалоспоринов), структура которого приведена ниже.



Выбор данного вещества обусловлен тем, что цефалоспорины широко используются для лечения и профилактики инфекционных офтальмологических заболеваний. Эти вещества мало токсичны и могут применяться в виде водных растворов с высокой концентрацией лекарства. В работах [6–8] показано, что при насыщении различных гидрогелевых мягких контактных линз из сравнительно концентрированных растворов це-фалоспоринов (5–10 мас. %) удается создать лечебные линзы, содержащие достаточно большое количество лекарственного вещества. Недостатком этих линз является слишком быстрое высвобождение цефалоспорина из гидрогеля, что приводит к неэффективному расходованию лекарства, вследствие малого времени контакта вещества с роговицей глаза и его быстрого вымывания из конъюнктивальной полости слезной жидкостью. В связи с этим задачей исследования является не только повышение сорбционной емкости гидрогеля по отношению к целевому веществу, но и определение условий, при которых реализуется высвобождение лекарственного препарата из гидрогеля в пролонгированном режиме.

Основным мономером при получении гидрогелей служил 2-гидроксиэтилметакрилат (ГЭМА). Сшивающий мономер – N,N-метиленбисакри-ламид (МБАА), мономеры, содержащие функциональные группы, – акриловая кислота (АК) (анионные группы) и 2-диметиламиноэтилмета-крилат (ДМАЭМА) (катионные группы). Функциональные мономеры вводили в состав сополимера в количестве 3 мол. %. В соответствии с литературными данными [2, 9, 10] применяли повышенные концентрации сшивающего мономера (4 мол. %) для обеспечения достаточной прочности нанопор, которые должны “запомнить” форму молекул лекарственного вещества.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы

Коммерческие продукты ГЭМА при Т_кип = = 87^оС/665 Па, n_D²⁰ = 1.4510, АК при Т_кип =

= 886°С/1.33 × 10⁴ Па, n_D²⁰ = 1.4224, ДМАЭМА фирмы “Lancaster” (Англия) при Т_кип = 186°С,

n_D²⁰ = 1.44396 очищали вакуумной перегонкой. МБАА при Т_пл = 300°С (фирма “Sigma-Aldrich”, США) использовали без дополнительной очистки.

Инициатор пероксидисульфат аммония очищали перекристаллизацией из воды. N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин (ТМЭДА) (Открытое акционерное общество “Вектон”, Санкт-Петербург), Т_кип = 121.5^оС, n_D²⁰ = 1.4148 применяли без дополнительной очистки.

Цефазолин – препарат производства Открытого акционерного общества “Биохимик” (Саранск) был взят в виде натриевой соли, хлористый натрий (Открытое акционерное общество “Вектон”, Санкт-Петербург) – в виде изотонического раствора (0.9 мас. %), двузамещенный фосфат натрия (Открытое акционерное общество “Вектон”) – в виде 0.05 М водного раствора, соляная кислота – в виде 0.1 н раствора.

Для проведения сополимеризации, приготовления растворов и при исследовании физико-химических свойств гидрогелей использовали дистиллированную воду.

Сополимеризация

Сополимеризацию в водной среде осуществляли в формах, изготовленных из фторопласта-4, при 20°С в течение 1.5 ч. Перед проведением со-полимеризации реакционные смеси освобождали от растворенного кислорода путем барботажа через растворы инертного газа. При сополимериза-ции в водной системе пероксидисульфат аммония вводили в реакционную смесь непосредственно перед ее загрузкой в полимерную форму. Сополимеризацию осуществляли практически до полного превращения мономеров в сополимеры. При получении гидрогелей “imprinted” цефазолин вводили в реакционную смесь в расчете 1 : 4 моля звеньев АК. Такое соотношение для многих лекарственных веществ, сочетающихся с сополимерами, содержащими АК, часто является оптимальным [5, 9, 10].

Составы реакционных смесей приведены в табл. 1. Полученные полимерные заготовки представляли собой набухшие в воде пластины толщиной 0.4–0.7 мм, из которых вырубали диски диаметром 12 мм. Диски для удаления остаточных мономеров и растворенного цефазолина промывали в различных водных растворах. Вначале образцы помещали в дистиллированную воду
Та бл и ца 1 . Рецептуры получения сополимеров

Сополимер	Содержание компонентов, мас. ч.
	ГЭМА	АК	ДМАЭМА	МБАА	ПА	ТМЭДА	цефазолин	вода
1	92.39	1.67	-	5.94	1.0	0.99	-	49.8
1 “imprinted”	92.39	1.67	-	5.94	1.0	0.99	2.64	49.8
2	90.59	-	3.63	5.78	1.01	0.50	-	50.4
2 “imprinted”	90.59	-	3.63	5.78	1.01	0.50	2.63	50.4
3	88.78	1.77	3.59	5.86	1.02	0.51	-	49.8
3 “imprinted”	88.78	1.77	3.59	5.86	1.02	0.51	2.64	49.8

на 2 суток, затем в раствор фосфата натрия также на 2 суток. После этого образцы промывали в течение суток в 0.1 н НСl и затем снова в дистиллированной воде в течение 2 суток. Полноту удаления цефазолина оценивали по отсутствию в УФ-спек-тре на стадии заключительной водной промывки поглощения в области 270 нм. После завершения промывания образцы высушивали до постоянной массы при 50°С.

Исследование набухания полимерных образцов в водных растворах

При исследовании набухания сополимеров образцы выдерживали в водных растворах не менее 24 ч. При изучении кинетики набухания образцы периодически извлекали из раствора и удалив с их поверхности влагу фильтровальной бумагой, взвешивали на аналитических весах. Равновесную степень набухания образцов определяли по формуле


где W_w – масса влажного образца, W_d – масса сухого образца.
Исследование гидрогелей методом малоуглового рассеяния нейтронов

Метод малоуглового рассеяния нейтронов применяли для изучения структуры полимерных гидрогелей, синтезированных в водной среде. Исследование проводили на дифрактометре “Мембрана-2” в диапазоне переданных импульсов q = (4rc/A,)sin(0/2) = 0.03–0.8 нм^-1 (к = 0.3 нм – длина волны при ширине спектра АХ/Х = 0.3,9 – угол рассеяния нейтронов). Для расшифровки структуры гидрогелей использовали метод изотопного водородно-дейтериевого контрастирования, основанного на большой разнице в амплитудах когерентного ядерного рассеяния для водорода и дейтерия [11]. С этой целью высушенные на воздухе образцы насыщали тяжелой водой D₂O до

состояния равновесного набухания в течение длительного времени (не менее суток). В объеме гидрогеля при замене легкой воды H₂O на тяжелую воду D₂O более чем на порядок усиливается контраст в рассеянии нейтронов между цепями сетки и насыщающей ее водой, что и позволяет надежно определять структуру системы. При анализе данных учитывали, что полимерные сетки содержат водород, вносящий в рассеяние значительный некогерентный вклад, пропорциональный концентрации протонов. Согласно химическому составу (табл. 1) содержание водорода в сухой сетке составляло: 7.60, 7.70 и 7.67 мас. % в образцах 1, 2 и 3 соответственно.

Чтобы выбрать оптимальные условия измерений, для образцов гидрогелей в виде пластин толщиной d ~ 0.7–0.9 мм определяли величины пропускания Tr – доли нейтронов, прошедших через образцы без рассеяния. Такие условия реализуются при толщине образцов d_S = 1.5–1.8 мм (исходные пластины складывали вдвое). При этом пропускание нейтронов Tr составляет 0.58–0.66, а величина некогерентного вклада b = 0.07–0.08 cм^-1. Выбранную толщину исследуемых объектов d_S = 2d учитывали при расчете сечений рассеяния в абсолютных единицах (на 1 см³ объема гидрогеля) dcy/dQ. = (I_S/I_w)(d_w/d_S)da_w/d£l с использованием в качестве эталона известного сечения рассеяния do_w/dQ. слоя легкой воды толщиной d_w = = 1 мм. Здесь I_S – интенсивность рассеяния от образца гидрогеля толщиной d_S.
Исследование поглощения цефазолина гидрогелями из водных растворов и его последующего высвобождения в изотонический раствор NaCl

При исследовании сорбции цефазолина образец сополимера массой 50–80 мг помещали в определенное количество (5–7 мл) разбавленного раствора лекарственного вещества (50 мг/л) и периодически производили измерение в растворе концентрации вещества. Процесс проводили до прекращения изменения концентрации цефазо-лина в растворе. Это событие считали моментом
Та бл и ца 2 . Равновесная степень набухания сополимеров в водной среде

Сополимер	Значения S0, г/г
	вода	раствор фосфата натрия	раствор НСl	раствор NaCl
1	0.779	0.825	0.495	0.709
1 “imprinted”	0.783	0.764	0.653	0.818
2	0.664	0.565	0.859	0.587
2 “imprinted”	0.799	0.698	1.079	0.695
3	0.972	0.712	0.852	0.681
3 “imprinted”	1.016	0.718	1.000	0.786

установления равновесной сорбции цефазолина гидрогелем. Количество W цефазолина, поглощенного образцом, рассчитывали по формуле

W = (C₀-C)V, (2)

где С₀ и С – начальная и текущая концентрации цефазолина в растворе, V – объем раствора. Символом W0 обозначали количество цефазолина (мг), поглощенного образцом к моменту достижения равновесной сорбции. Величину сорбции лекарства w₀ (в 1 мг цефазолина на 1 см³ гидрогеля) вычисляли по формуле

w₀ = w'₀p/(S₀ + 1), (3)

где р – плотность гидрогеля, w'₀ – сорбция лекарства (в 1 мг цефазолина на 1 г высушенного гидрогеля). Плотность гидрогеля находили при допущении, что этот параметр является аддитивной величиной, используя данные по плотности сополимеров (1.29 г/см³ [12]) и их степени набухания.

Концентрацию цефазолина в водных растворах определяли методом УФ-спектроскопии с помощью спектрофотометра СФ-2000 (Акционерное общество закрытого типа ОКБ “Спектр”, Санкт-Петербург). Измерения производили при длине волны 270 нм, соответствующей максимуму поглощения света. Предварительно получали калибровочную зависимость, из которой рассчитывали коэффициент экстинкции цефазолина (1.179 х 10⁴ л моль^–1 см^-1).

Высвобождение цефазолина из образцов, достигших равновесного насыщения, в определенное количество (100–200 мл) изотонического раствора NaCl изучали, периодически определяя концентрацию цефазолина в растворе. Момент установления в растворе постоянной концентрации лекарства считали моментом установления равновесия. В условиях эксперимента (отношение объемов гидрогеля и раствора менее 10–³) этот момент соответствовал практически полному высвобождению цефазолина из гидрогеля, на что указывало отсутствие в спектре гидрогеля поглощения при X = 270 нм. Таким образом, в опытах по десорбции цефазолина можно также опре-

делять W₀ и w₀. Так как в опытах по десорбции отобранные пробы не возвращали в исходный раствор, количество лекарственного вещества, высвободившегося из гидрогеля к моменту отбора пробы, вычисляли по формуле



где V₀ – начальный объем изотонического раствора NaCl, N – порядковый номер пробы, Р – объем

пробы (2.42 мл), C_N – концентрация цефазолина в растворе в момент отбора пробы с номером N.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Набухание синтезированных сополимеров в водных растворах

Из табл. 2 видно, что гидрогели “imprinted” имеют более высокую степень набухания по сравнению с исходными гидрогелями, полученными в отсутствие цефазолина. Этот результат может быть связан с тем, что цефазолин как высоко гидрофильное вещество с достаточно большой ММ (454 г/моль) оказывает влияние на структуру гидрогеля. Аналогичные результаты приведены в работе [13]. В цитируемой работе описаны гидрогели “imprinted” на основе сополимеров ГЭМА– АК–МБАА, полученные также в водной среде, в которых в качестве матрицы использовался 5-фторурацил. Авторы отмечают, что гидрогели “imprinted” имеют более высокую степень набухания по сравнению с аналогичными гидрогелями, синтезированными в отсутствие 5-фторура-цила. В то же время гидрогели, полученные в массе или органическом растворителе в присутствии лекарства, имеют те же параметры набухания, что и обычные гидрогели аналогичного химического состава [9, 10]. Приведенные данные позволяют предположить, что изменение параметров набухания гидрогелей связано с гидратацией лекарственного вещества и образованием гидрогелей с большим общим объемом пор.

Набухание гидрогелей в воде и водных растворах электролитов зависит от химического строения